ELETROFORESE
A eletroforese é uma importante técnica de análise de moléculas de DNA, enzimas e proteínas. Essa técnica é aplicada em inúmeras áreas que envolvem análises moleculares e bioquímica, como, pesquisa científica, clínica médica, estudos forenses, investigação e diagnóstico de doenças, identificação de espécies, dentre outras. Desde que foi desenvolvida, na década de 1930, a técnica tem sido aprimorada analiticamente, o que possibilita resultados excelentes, sendo considerada uma técnica sensível, facilmente reproduzível e amplamente difundida nos laboratórios. Embora seja uma técnica descrita há muitas décadas, a eletroforese se conserva com metodologias cada vez mais aprimoradas, destinadas a uso laboratorial, tanto em análises rotineiras em diversos seguimentos quanto em pesquisa científica.
O princípio da eletroforese é relativamente simples: ocorre, basicamente, o emprego de uma corrente elétrica contínua para a migração das partículas com cargas elétricas opostas. Portanto, a eletroforese pode ser definida como o movimento de uma molécula carregada (íon) em um campo elétrico, de acordo com sua carga e seu peso molecular. Deste modo, moléculas com carga elétrica negativa migram para o polo positivo (anodo) e, moléculas com carga elétrica positiva migram para o polo negativo (catodo).
Para a realização de uma eletroforese, três componentes básicos são indispensáveis:
1 Um campo elétrico, gerado através de uma fonte de corrente contínua
2 A molécula carregada
3 Um suporte, para o apoio da molécula carregada e sua migração, que deve ser química e fisicamente inerte, para que não interfira na mobilidade das moléculas. A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, sílica-gel, membranas de acetato de celulose e géis, que podem ser de agarose, de amigo ou de poliacrilamida. A depender da finalidade do experimento com eletroforese e das características das moléculas em questão, se dá a escolha do melhor tipo de suporte.
A eletroforese ocorre, com o suporte de apoio para a molécula, em uma
cuba, horizontal ou vertical, a depender do tipo de amostra utilizada, ligada a uma fonte de energia, que fornece a corrente necessária para a corrida das moléculas.
Além desses componentes, alguns outros fatores são determinantes para a realização da eletroforese, e destacaremos aqui alguns deles, especialmente para eletroforese ocorrida em géis.
A
porosidade do gel utilizado na eletroforese, influencia a fricção e a velocidade das moléculas em um campo elétrico. Nos
géis de amido, forma-se uma estrutura semi-rígida, de gel, diferente de um líquido viscoso. Nos
géis de poliacrilamida, a porosidade é definida pelo teor de seus componentes: acrilamida e metileno-bis-acrilamida (Bis), sendo que, a concentração de Bis determinará a porosidade do gel, uma vez que apenas a solução de acrilamida forma um líquido viscoso. Já os
géis de agarose apresentam porosidade bem maior da obtida em géis de poliacrilamida. A agarose permite a separação de ácidos nucleicos e outras moléculas de acordo com seus pesos moleculares, com uma rigidez mecânica bem superior das dos géis de poliacrilamida.
Para a realização da eletroforese é necessário que haja uma
solução tampão, que tem por finalidade garantir a estabilização do pH do meio permitindo, consequentemente, o fluxo da corrente elétrica. Na eletroforese, mais especificamente de ácidos nucleicos, os dois tampões mais utilizados são: TAE (Tris, Acetato e EDTA) e TBE (Tris, Borato e EDTA).
Para a visualização de um padrão do peso molecular das moléculas em questão no experimento com eletroforese, utiliza-se um marcador de peso molecular, também conhecido como escada, ou
ladder. Os ladders são misturas de fragmentos das moléculas (proteínas ou ácidos nucleicos), de tamanhos conhecidos. Esses fragmentos quando visualizados em um
gel de eletroforese servem como uma referência para comparar os fragmentos das moléculas em amostras experimentais. Ao correr lado a lado com amostras desconhecidas, o ladder permitem a determinação do tamanho dos fragmentos presentes nas amostras.
A utilização de um
corante também é necessária nos experimentos com eletroforese, para que seja possível a visualização das bandas formandas pelas moléculas separadas na eletroforese. Os corantes são importantes também para que se avalie a qualidade e pssíveis contaminações das amostras. Essas substâncias ligam-se às moléculas das amostras, emitindo uma fluorescência sob luz UV, permitindo assim sua visualização.
Após a corrida das amostras na eletroforese, o resultado é analisado atráves de um aparelho denominado transiluminador UV, que é um dispositivo emissor de luz ultravioleta (UV) de alta intensidade para que as amostras fluorescentes (moléculas marcadas com corante) possam ser vistos claramente. A luz UV excita os produtos fluorescentes na amostra, iluminando-os. Os produtos fluorescentes podem, portanto, ser visualizados na forma de bandas brilhantes.