O microrganismo Gram Positivo Clostridium perfringens é amplamente reconhecido como sendo um valioso indicador de contaminação fecal em amostras de água. Esses microrganismos formam esporos que são formas resistentes ao aquecimento em comparação com as células vegetativas.  Os esporos de C. perfringens sobrevivem na água por meses, muito mais tempo que as demais bactérias indicadoras fecais vegetativas e, consequentemente, sua presença pode indicar poluição fecal remota ou intermitente. Eletromicrofotografia de varredura (colorida artificialmente) de cepas de Clostridium perfrinfens O monitoramento de C. perfringens tem se mostrado útil para a avaliação da qualidade dos recursos hídricos e para verificar as etapas do tratamento da água para avaliar o desempenho das obras de tratamento. Nem sempre os esporos de C. perfringens são inativados por procedimentos de desinfecção de comumente empregados (por exemplo, cloração). A ISO 14189:2013 trata da enumeração de Clostridium perfringens utilizando o método por filtração em membrana (membrana filtrante). Este método foi desenvolvido para amostras de água destinada ao consumo humano. Porém, pode ser aplicado a todos os tipos de amostras de água, desde que não contenham partículas ou matéria coloidal que interfira com a filtração. Dependendo da amostra (se a intenção for contar somente esporos) aquecer a amostra a 60±2°C em banho de água por 15±1 minutos É utilizado membrana com poro de tamanho 0,45µm que é capaz de reter esporos de clostridia. A membrana é incubada sobre o meio TSC (triptose sulfito cicloserina ágar) anaerobicamente a 44±1 °C por 21±3 h. Colônias características de Clostridium perfringens normalmente produzem colônias negras ou cinzas a marrom amareladas decorrente da redução do sulfeto a sulfito que reagem com o metabissulfito de sódio e com o citrato férrico presente na composição do meio. Meio TSC contendo Clostridium perfringens Ao se encontrar colônias típicas, estas são contadas e devem ser confirmadas. A confirmação se dá pela determinação da fosfatase ácida. Esta determinação é realizada através do uso do Reagente Fosfatase Ácida (R096 https://himedialabs.com/TD/r096.pdf). A fosfatase ácida produzida por C. perfringens catalisa a hidrólise do α-naphthylphosphate , ocorrendo a liberação de α- naftol e fosfato formando que forma um corante azo com diazônio o-dianisidina, que possui uma forte absorbância a 405 nm. O aumento da absorbância é diretamente proporcional ao nível da enzima fosfatase ácida. O resultado positivo para a fosfatase ácida resulta como a formação de uma cor púrpura forte ocorrendo entre 3-4 minutos após a adição do reagente. Teste Fosfatase Ácida Positivo Teste Fosfatase Ácida Negativo  

FICA A DICA:

Durante o preparo da amostra (realização do pré-aquecimento quando necessário), o tempo para atingir a temperatura 60±2°C não deve ultrapassar os 15 minutos. Este procedimento pode ser otimizado fazendo com que a água no banho-maria circule para maximizar a troca de calor Após o crescimento de colônias típicas no meio TSC, as mesmas devem ser subcultivadas anaerobicamente por 21±3 horas a 36±2 °C em meio não seletivo (Ágar sangue ou Ágar Columbia Base ou Agar TSA).   Sobre o Reagente de fosfatase ácida: - Quando em repouso pode-se formar um precipitado. Neste caso, o reagente pode ser filtrado e o reagente utilizado normalmente para teste. - Devido à composição do produto, pode ocorrer a formação de espuma o que não afetará os critérios de desempenho do reagente Nós da Êxodo Científica possuímos todos os meios de cultura necessários para o Isolamento de Clostridium conforme a ISO 14189. O reagente de Fosfatase Ácida (R096) como possui a validade mais restrita (5 meses a partir da fabricação) atendemos a comercialização deste item através de importação sob demanda para que possamos oferecer o produto com a maior validade possível). Consulte-nos para maiores informações!!! microbiologia@exodocientifica.com.br