MAPA IN nº60 de 2018! ALIMENTOS , ANÁLISES CLÍNICAS, AMBIENTAL, PRODUTOS LÁCTEOS. Recentemente o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) através da Instrução Normativa Nº 60 de 2018, torna obrigatório o controle microbiológico em carcaça de suínos e em carcaça e carne de bovinos em abatedouros frigoríficos, registrados no Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal (DIPOA), com objetivo de avaliar a higiene do processo e reduzir a prevalência de agentes patogênicos.   Dentre os patógenos, ficou estabelecido a pesquisa de:  Enterobacteriaceae e Salmonella spp. em carcaça de suínos; Enterobacteriaceae e Salmonella spp. em carcaça de bovinos; Escherichia coli produtora de Shiga toxina, (STEC) em carne de bovinos;     Enterobacteriaceae e Salmonella spp eram microrganismos rotineiramente pesquisados em várias fontes de materiais até então. Na legislação Brasileira, foi a primeira vez que Escherichia coli produtora de Shiga toxina se tornou obrigatório!     Escherichia coli O157:H7 pertece ao grupo de entero hemorrágicas Escherichia coli (EHEC) e predomina como um patógeno de origem alimentar.

1. coli O157: H7 foi primeiramente diagnosticado em 1982 como patógeno humano quando, dois surtos de coli hemorrágica foram associados ao consumo de carne mal cozida que estava contaminada por este microrganismo.

As cepas entero hemorrágicas de E. coli  são também denominadas E. coli  produtoras de verocitotoxinas (VTEC / EHEC). Embora muitos sorotipos diferentes de Escherichia coli  são conhecidos por produzir verocitotoxinas, as Escherichia coli  O157: H7 e O157: H são até agora os tipos mais comuns que causam infecções humanas. Nos últimos anos, Escherichia coli  O157: H7, vem ganhando notoriedade mundial , pois a mesma está envolvida em graves e severos surtos alimentares cada vez mais constantes. Nesta publicação iremos tratar sobre a metodologia para isolamento de Escherichia coli  O157: H7 fazendo uso do enriquecimento seletivo (realizado em caldo cromogênico) e do plaqueamento fazendo uso de meio de cultura cromogênico. Esta técnica se adequa em diferentes materiais tais como: carcaças, alimentos, amostras clínicas, produtos lácteos e amostras ambientais.

1. Enriquecimento seletivo

Para o enriquecimento seletivo, o material é incubado no caldo HiCrome™ Enrichment Broth Base for EC 0157:H7 (M1598).

• Para amostras clínicas, o preenriquecimento pode ser realizado a partir de fezes conservadas em meio Cary Blair ou em fezes frescas (desde que coletadas e incubadas até 2 horas após a coleta)
• Para amostras de swabs de carcaças e amostra ambiental, inocular o liquido diluente com o swab (sempre na proporção de 1:9 de liquido diluente e HiCrome™ Enrichment Broth Base for EC 0157:H7)

Este meio possui triptona que fornece nitrogênio, compostos de carbono, aminoácidos de cadeia longa e outros nutrientes essenciais para o desenvolvimento de cepas de E. coli O157:H7. Sorbitol é o açúcar presente no meio (cepas Escherichia coli O157:H7 fermentam a lactose, mas não fermentam o sorbitol [em sua maioria]). A presença de sais biliares inibem o crescimento de gram positivas. A adição de telurito (Suplemento FD230) torna o meio muito mais seletivo (a presença de telurito de potássio no meio inibe o desenvolvimento de cepas de E. coli não patogênicas, presentes na flora intestinal o que torna seu uso muito atrativo para amostras clínicas ). Quando não adicionado o suplemento FD230, cepas de E. coli não patogênicas (como exemplo as presentes na flora intestinal), faz comque o meio mude para a coloração azulada. Contudo, quando presente, E. coli O157:H7 transforma a coloração do meio para ROXO (resultante da ausencia da atividade de ß-glucoronidase e da incapacidade de fermentar o sorbitol). Esta fase de pré-enriquecimento deve ser realizada  a 35-37°C por 18-24 horas.  

1. Plaqueamento em meio diferencial : HiCrome™ EC 0157:H7 Selective Agar Base, Modified ( M1575A)

Este meio tem uma aplicabilidade muito grande, pois pode ser utilizado não somente  como meio suplementar ao MacConkey com Sorbitol (se adequa perfeitamente como 2º meio de escolha referente ISO 16654:2001), como possui um desempenho superior ao próprio MacConkey com Sorbitol (que por sua vez não detecta cepas de E. coli O157 que fermentam este mesmo carboidrato) este meio baseia na clivagem de substratos cromogênicos específicos para E. coli O 157. O meio HiCrome™ EC 0157:H7 Selective Agar Base, Modified (M1575A) contém sorbitol e uma mistura cromogênica específica em vez de lactose e corantes indicadores, respectivamente. O substrato cromogênico presente no meio é metabolizado específica e seletivamente por Escherichia coli O157: H7 (as cepas de E. coli O157:H7 resultam em uma coloração púrpura a magenta. As estirpes de E. coli que não são produtoras de toxina resultam em colônias de coloração verde azulada) O meio HiCrome™ EC 0157:H7 Selective Agar Base, Modified ( M1575A) possui em sua composição triptona e extrato de levedura como sendo fornecem carbono, nitrogênio e nutrientes. A presença do suplemento HiCrome™ EC O157:H7 Selective Supplement (FD187) torna o meio seletivo. O telurito de Potássio inibe seletivamente as espécies Aeromonas e Providencia (o que ajuda por sua vez sua aplicabilidade em amostras ambientais)  . Novobiocina inibe bactérias gram-positivas. Lauril sulfato de sódio ajuda a inibir a flora gram-positiva presente no material. Quando utilizado o caldo HiCrome™ Enrichment Broth Base for EC 0157:H7 (M1598) e o meio alterar de cor para ROXO, estriar uma alçada no meio HiCrome™ EC 0157:H7 Selective Agar Base, Modified (M1575A). Incubar a 35-37°C por 18-24 horas. Na presença do desenvolvimento de colônias  magentas a rosas, realizar a sorologia mediante anticorpos do sorotipo de E. coli O157. Nós da Exodo Científica, somos distribuidores autorizados da Marca Himedia no Brasil. Possuímos à pronta entrega todos os meios citados para o isolamento seletivo e identificação de Escherichia coli produtoras de toxina. Consulte-nos sobre os meios de cultura, suplementos e muito mais! microbiologia@exodocientifica.com.br