O desenvolvimento da técnica de PCR, na década de 80, foi um marco na história da ciência e, desde então, os cientistas têm buscado aprimorá-la, alinhando novas descobertas científicas e avanços tecnológicos. A técnica de PCR se baseia na produção rápida de milhões de cópias de um fragmento específico de DNA. A partir de pequenos fragmentos de DNA sintético, chamados de primers, é possível selecionar um segmento do genoma que se pretende amplificar. Em seguida, com várias repetições da síntese deste fragmento de DNA, ele é amplificado. Na reação de PCR, uma enzima tem papel fundamental na síntese de uma nova fita de DNA complementar a partir da fita molde, a DNA polimerase. O método de PCR convencional é utilizado para multiplicar uma região específica do DNA, com o objetivo de amplificar a sua concentração até que ela possa ser detectada. A reação de PCR convencional contém a enzima DNA polimerase, íons de Mg2+ e desoxinucleotídeos (ATP, TTP, CTP e GTP). Com os avanços científicos dos últimos anos, a técnica de PCR foi aprimorada, garantindo a possibilidade de análises rápidas em diferentes áreas. Enquanto a PCR convencional é eficaz na identificação da presença ou ausência de um fragmento de DNA ou gene em um determinado organismos e amostra, algumas variações nos tipos de PCR desempenham análises mais específicas. A técnica de PCR possui mais de dez diferentes variações, cada qual visando uma melhor aplicabilidade, a depender do objetivo da análise. De todas, algumas têm sido mais exploradas e divulgadas popularmente e possuem aplicabilidade de maior destaque:   PCR em Tempo Real ou qPCR O processo de quantificação de fragmentos de DNA e RNA foi revolucionado com o surgimento da PCR em tempo real. Essa técnica realiza a quantificação dos ácidos nucléicos de maneira precisa e com grande reprodutibilidade, determinando valores ainda durante a reação, em sua fase exponencial, baseados em fluorescência. A emissão de fluorescência gera um sinal que se eleva na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Os valores da fluorescência são gravados durante cada ciclo e refletem a quantidade de produto amplificado. Para a realização da PCR em tempo real é necessária uma plataforma de instrumentação contendo um termociclador com sistema ótico para a excitação da fluorescência e coleta da emissão, além de um software para a aquisição dos dados, para posterior análise final da reação. Com os avanços nas pesquisas científicas nas últimas décadas, o uso da PCR em Tempo Real tem se tornado uma alternativa cada vez mais presente em análises moleculares para diversas aplicações, como as relacionadas à análise de expressão gênica, controle de qualidade, quantificação viral, detecção de agentes patogênicos, toxicologia forense, genotipagem, oncologia, dentre muitas outras. RT-PCR – PCR de Transcriptase Reversa Uma outra técnica de PCR, a técnica por Transcriptase Reserva ocorre a partir de moléculas de RNA, que são convertidas em DNA complementar (cDNA) por meio da atividade da enzima transcriptase reversa (também conhecida como DNA polimerase RNA-dependente). E então, os cDNAs recém-sintetizados são amplificados através do mesmo princípio da PCR convencional. O cDNA representa a maneira mais conveniente de manipulação da sequência codificada a partir do RNA (neste caso, o mRNA- RNA mensageiro), já que a molécula de RNA é facilmente degradada, por enzimas denominadas RNases. Uma vez que a técnica de RT-PCR permite a amplificação de amostras a partir de RNA, este método tem ampla aplicação na detecção de doenças genéticas, patógenos virais e bacterianos. Além dessas duas formas de uso da técnica PCR, bastante usuais, podemos citar alguns outros tipos de PCR, que buscam atender diferentes necessidades:  

• PCR Hot-Start

A PCR Hot-Start é uma variante da PCR, desenvolvida para suprimir a atividade enzimática, geralmente da Taq DNA polimerase, até que a primeira etapa de desnaturação tenha sido concluída. Ela atua desta maneira evitando que a reação de PCR fique em temperatura ambiente durante a configuração do ensaio (e antes do ciclo térmico) quando uma amplificação não específica pode ocorrer, causando uma falha na reação de PCR. A PCR Hot-Start melhora a especificidade e a sensibilidade da amplificação do DNA.

• PCR Nested

A PCR Nested possui o mesmo princípio da PCR convencional, se diferenciando na origem da amostra que contém o material genético a ser utilizado na reação. Na PCR nested, ao invés de se usar apenas uma amostra primária para fazer a PCR, utiliza-se o produto de uma PCR realizada anteriormente, com um par de primers internos ao par utilizado na primeira reação. Em outras palavras, se trata de uma PCR do produto de outra PCR. Essa variação da PCR busca aumentar a sensibilidade e especificidade da reação, em casos em que as amostras utilizadas não são tão boas ou tão disponíveis, como quando estão em pouco quantidade ou no caso de genes pouco expressos.

• PCR Direta

A PCR direta é uma técnica para amplificação de DNA sem que haja extração ou purificação prévia, a partir de amostras biológicas complexas. Com a utilização de reagentes e enzimas específicos, para atuar contra inibidores presentes na amostra, esta PCR otimiza o protocolo, economiza tempo e reduz as chances de contaminação, visando uma maior eficiência na amplificação do DNA. A técnica é eficaz em diagnósticos clínicos, em testes rápidos para patógenos, a partir das amostras de pacientes, diretamente. A PCR direta também é muito utilizada em pesquisas de campo, em análises genéticas fora do laboratório convencional. E na biologia forense é uma técnica extremamente útil, proporcionando processamento rápido de evidências biológicas, superando métodos tradicionais.

• ‍PCR em Fragmentos Ricos em GC

A PCR em fragmentos ricos em GC é uma técnica específica para a amplificação de regiões de DNA com alto conteúdo de guanina (G) e citosina (C). Essas regiões possuem ligação mais forte de hidrogênio e uma estrutura mais estável, o que dificulta a desnaturação e o anelamento dos primers. A técnica utiliza condições bem específicas para a reação: o reagente DMSO ou betaina, que ajudam na etapa de desnaturação; temperaturas de desnaturação mais elevadas; uso de primers altamente específicos; enzimas polimerases de alta processividade (resistentes a inibidores).

• PCR Touchdown

A PCR touchdown é uma técnica de amplificação cujas temperaturas de anelamento são gradualmente reduzidas a cada ciclo, visando o aumento da especificidade da amplificação e evitando a formação de produtos inespecíficos, como dímeros de primers, por exemplo. Durante os primeiros ciclos de amplificação, o anelamento ocorre a uma temperatura acima da temperatura de fusão dos primers, garantindo a especificidade da ligação entre os primers e o DNA alvo. Ao longo da progressão dos ciclos, a temperatura de anelamento é reduzida gradualmente, garantindo que os primers se liguem de forma mais eficiente às sequências específicas de DNA.  

• PCR Rápida

É uma técnica de PCR utilizada para acelerar o processo de amplificação de DNA e, consequentemente, reduzir o tempo necessário para a análise. A técnica é útil em situações em que a rapidez é essencial, como em diagnósticos de doenças infecciosas ou monitoramento de epidemias, que necessitam de resultados rápidos. A PCR Rápida utiliza enzimas termoestáveis e otimizadas, de alta processividade. Na PCR Rápida os ciclos de amplificação são executados mais rapidamente, em média, em um período de 30 a 60 minutos, em comparação com as 2 horas mínimas necessárias na reação de PCR convencional.  

• PCR Multiplex

Esta técnica promove a amplificação simultânea de múltiplos alvos de DNA em uma única reação, de maneira eficiente e econômica. A PCR Multiplex é bastante empregada em análises de expressão gênica, diagnósticos moleculares e estudos genéticos, visando a detecção de múltiplos genes ou sequências genômicas em uma única análise. Na PCR Multiplex são utilizados primers específicos para cada alvo, juntamente com fluoróforos/sondas distintas, para diferenciar os produtos amplificados. Esta técnica proporciona precisão e confiabilidade na identificação e quantificação de múltiplos fragmentos de DNA.

• PCR Longa

Esta técnica é utilizada na amplificar fragmentos de DNA maiores do que os amplificados pela PCR convencional, em geral maiores que 5kb. Na PCR longa as condições de reação são otimizadas, como: concentração de primers, enzimas de alta processividade e fidelidade, e ciclos de amplificação prolongados, com o intuito de se obter uma amplificação eficiente de fragmentos maiores. A PCR longa ocorre em um período de aproximadamente 10 horas.

• PCR Inversa

A PCR Inversa é a técnica utilizada quando se busca identificar uma sequência desconhecida, localizada próxima a uma sequência já conhecida, a partir de uma sequência promotora do gene, por exemplo. É utilizada em técnicas como as relacionadas à fusão gênica, translocação e integração viral.

• PCR Digital

A PCR digital é uma técnica sensível, que permite a detecção de eventos raros, como mutações de um único nucleotídeo em meio a uma população predominante de sequências, e a amplificação de sequências escassas, buscando uma quantificação precisa e sensível. Nesta técnica a amostra é particionada milhares de vezes, formando porções de poucas moléculas de molde. Cada parte dessas poucas moléculas funciona como reações de PCR individuais, identificando o DNA alvo amplificado por meio de sondas fluorescentes. Por um método estatístico (Poisson), é possível determinar a quantidade absoluta de DNA, independentemente do número de ciclos de amplificação. Esta determinação ocorre com uma precisão muito alta para a detecção de sequências raras e análise de variação no número de cópias.   De todo modo, seja qual for a técnica empregada, o tipo de amostra e o objetivo da análise, é fato que a PCR é fundamental, atualmente e daqui em diante, para os avanços científicos em diferentes áreas da Ciência.