Linha de Cultivo Celular animal (ATC) – Meios de cultura Clássicos

Postado por: Êxodo Cientifica - 3 anos

O cultivo celular animal (ATC) consiste nos processos de isolamento, propagação e manutenção de células de determinado tecido em um sistema in vitro. Este sistema é composto por elementos essenciais ao desenvolvimento e, também, é constituído por condições ambientais tais como, temperatura, pH, teor de CO2 etc. Todos estes elementos (nutricionais + fatores ambientais) são essenciais para a sobrevivência de tais estruturas celulares.

O cultivo celular animal teve seu desenvolvimento iniciado há mais de um século, onde, no ano de 1897, Leo Loeb (1869 – 1959) havia reconhecido os  “princípios gerais” e importância do crescimento de células em ambiente artificial através de seu trabalho com tecidos embebidos em ágar ou coágulos de plasma e implantados em animais, foram a primeira tentativa registrada na literatura para o crescimento de tecidos de animais superiores sob condições artificiais em “ambientes que diferem daqueles encontrados no corpo sob condições naturais”.

Leo Loeb

Os primeiros meios de cultura desenvolvidos e usados com sucesso para o cultivo de células animais eram tipicamente compostos de plasma, soro, linfa ou extratos de tecidos. A natureza complexa e indefinida destes constituintes biológicos resultavam em uma grande variabilidade, levava ao aumento do risco de contaminação e impediu a elucidação dos nutrientes mínimos e específicos necessários para apoiar o crescimento das células nestes respectivos meios.

Ao desenvolver um novo método de cultura, sempre se enfrenta vários desafios. Um desses é realizar e garantir a manutenção das células e dos tecidos nos meios devido à grande discrepância entre a cinética celular in vivo e a cinética celular in vitro. A principal razão para tal, é a grande dificuldade em reproduzir um microambiente artificial em que as células se comportam como se estivessem em seu ambiente fisiológico natural.

Um microambiente artificial para células cultivadas é formado por vários fatores, incluindo citocinas, material de suporte, interações célula-célula e manutenção do estresse físico. Dado que vários fatores modulam o comportamento e a função das células cultivadas em condições normais. Células viáveis ​​em condições patológicas são submetidas a combinações ainda mais aberrantes, ou seja, são adicionados ao meios mais toxinas, edemas, ascite e temperatura diferenciada. Esses fatores ambientais anormais levam à ativação de reações patológicas nas células in vivo. Pode-se ver, portanto, que é extremamente difícil reproduzir um microambiente anatômico ou fisiológico simplesmente recorrendo a um sistema de cultura convencional específico.

Por essas razões, muitos grupos de pesquisa procuraram desenvolver meios de cultura quimicamente definidos sem soro (serum-free) por meio da análise da composição celular dos elementos dos soros, onde se procurava mimetizar estes elementos nos meios de cultura, e através da identificação de componentes-chave necessários e essenciais para garantir o desenvolvimento das culturas.

O trabalho pioneiro realizado por Harry Eagle, culminou no desenvolvimento de uma formulação básica, que poderia suportar o crescimento de duas linhagens celulares diferentes, fibroblastos L de camundongo e células HeLa (carcinoma uterino humano).

Harry Eagle

O meio inicial de Eagle continha “uma mistura arbitrária de aminoácidos, vitaminas, cofatores, carboidratos e sais” junto com soro dialisado. Esse meio foi “batizado” de Essential Medium (MEM). O MEM é composto por 28 metabólitos essenciais que, quando suplementados com soro, podem suportar a propagação de uma ampla variedade de linhagens celulares com tempos de duplicação de 18 a 24 h. Embora este meio contenha soro em sua composição, sua formulação ainda é a base para muitos meios de cultura de células amplamente usados até ​​hoje. Como exemplo, o DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) de Dulbecco e Freeman foi resultante de uma versão modificada do meio de Eagle contendo uma concentração quatro vezes maior de aminoácidos e vitaminas em relação ao MEM. Esta formulação demonstrou suportar crescimento aprimorado e densidades celulares mais altas em relação ao MEM e acabou sendo usado como base para várias formulações de meios isentos de soro.

A mistura de nutrientes de Ham F12, foi um exemplo inicial bem-sucedido de um meio de cultura totalmente sintético, quimicamente definido e livre de soro que poderia suportar o crescimento clonal de células de ovário de hamster chinês (CHO- Chinese Hamster Ovary). Este meio (Nutriente Mixture F12- Ham) foi projetado para o cultivo e expansão de células únicas, mas não era adequado para suportar o crescimento de altas densidades celulares (superiores a 10⁵ células por ml).

Sato et al. determinaram posteriormente que essa deficiência poderia ser remediada pela mistura do F12- Ham com o meio de Dulbecco, além da suplementação com hormônios, fatores de crescimento e transferrina, resultando assim em uma nova formulação chamada DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/ Nutrient Mixture F-12 Ham). Nesta nova composição, Hiroki Murakami et al. identificaram quatro aditivos críticos necessários para a reposição do soro em meios quimicamente definidos: insulina, transferrina, etanolamina e selênio. Combinados, esses quatro aditivos formaram um suplemento (ITES), que foi usado como componente quimicamente definido para substituição do soro. Além disso, a equipe de Murakami melhorou mais os meios existentes misturando formulações já conhecidas, como DMEM/F12 com outras como o RPMI-1640.

Os meios RPMI são uma série de meios desenvolvidos por Moore et al para a cultura de células normais e neoplásicas humanas in vitro. O meio RPMI-1640, por sua vez, é um meio de cultura de células proposto pelo Roswell Park Memorial Institute (Buffalo, NY) que resultou na cultura bem-sucedida de linfócitos humanos.

A mistura do RPMI com o DMEM/F12 juntamente com o suplemento ITES como substituto da remoção do soro, gerou o meio RDF basal e, posteriormente, o RDF enriquecido (eRDF).

Yap et al. avaliaram ainda mais o papel de metais traços em meios de cultura de células sem soro, identificando atividades miméticas à insulina mediadas sobre as culturas através do zinco, o que levou sua demonstração como substituto de insulina em meios quimicamente definidos e isentos de proteínas.

A seguinte tabela apresenta a composição de diferentes meios de cultura clássicos destinados ao cultivo animal.

Usualmente os meios destinados para o cultivo celular animal são preparados a partir do meio desidratado que é reconstituído em água, filtrado em membrana e adicionado os devidos suplementos (nutrientes, antibióticos, fatores de crescimento etc.) ou frequentemente se utiliza dos meios já prontos para o uso.

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Referências:

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