Meio Ácido Fólico Casei

Meio Ácido Fólico Casei

Postado por: Êxodo Cientifica - 1 mês

Meio Ácido Fólico Casei (para o ensaio microbiológico de ácido fólico no soro sanguíneo ) à pronta entrega!

O Meio Folic Acid Casei é utilizado em ensaios para a quantificação de ácido fólico em amostras de soro, fazendo uso de Lactobacillus casei  ATCC 7469 como o organismo de teste.

O ácido fólico também chamado de folacina, ácido pteroil-L-glutâmico ou Vitamina B9 atua na prevenção de anomalias congênitas no primeiro trimestre da gestação resultantes do desenvolvimento do tubo neural, que entre os dias 18 e 26 do período embrionário transforma-se na espinha. Defeitos do tubo neural são malformações que ocorrem no início do desenvolvimento fetal, sendo os principais a anencefalia e espinha bífida. A dose diária recomendada é de 600 mcg no período de no mínimo um mês antes da concepção até três meses ou 12 semanas de gravidez (1º trimestre).

Pessoas normais possuem um nível de ácido fólico de 9,9 ng/mL. Existem alteração destes níveis em certas anormalidades e patologias.

O Meio Ácido Fólico Casei É utilizado para o ensaio microbiológico de ácido fólico no soro usando a cepa padrão de Lactobacillus casei  ATCC 7469 Como microrganismo teste. Este meio possui a formulação estabelecida por Flynn, modificado  por Baker e Waters e Mollin.

Para a realização deste (e demais testes envolvendo ensaios de vitaminas) é necessário o emprego de 3 meios distintos (um para a manutenção da cultura do microrganismo, um meio para inoculação e um meio para realização dos testes). Este terceiro meio geralmente é um meio definido quimicamente que contém todos  os ingredientes e nutrientes essenciais para o crescimento dos organismos o qual será adicionado o material a ser analisado.

Da mesma forma, o Meio Folic Acid Casei contém todos os nutrientes essenciais para o crescimento de L. casei, exceto o ácido fólico. Portanto, a adição de ácido fólico em concentrações crescentes especificadas  no Meio Folic Acid Casei especificadas garante  um aumento na resposta de crescimento de L. casei que em concentrações conhecidas é utilizado como referência para a determinação de uma curva padrão.

Técnica:

I- Preparo e manutenção das cepas de Lactobacillus casei ATCC 7469

-A cultura estoque de Lactobacillus casei ATCC 7469 são cultivadas por punção em tubos de ensaio no Lactobacilli Agar AOAC (M366). Incubar a 35ºC-37ºC por 18h-24h. Após este período manter os tubos armazenados em geladeira. Repicar para outro meio Lactobacilli Agar AOAC (M366) mensalmente para a manutenção da cultura.

II- Teste

– O inóculo para o ensaio é preparado através da  subcultura obtida anteriormente (Lactobacillus casei ATCC 7469), desta vez as cepas no meio de estoque são inoculadas em um tubo contendo 10mL do meio Micro Vitamin Test Inoculum Broth (M133) ou Lactobacilli Broth (M367) por 24 horas a 35-37°C. Esta suspensão bacteriana é centrifugada em condições assépticas , o sobrenadante é descartado. As células são ressuspendidas em 10ml

do Meio Ácido Fólico Casei, ressedimentado (centrifugado novamente) e lavado mais uma vez. Finalmente o lavado celular é ressupendido em 10mL do Meio Ácido Fólico Casei (concentração simples). Diluir esta suspensão 1:100 com o mesmo meio. Uma gota desta suspensão é usada para inocular cada tubo de ensaio.

Uma curva padrão para cada ensaio deve ser realizada utilizando ácido fólico nas seguintes concentrações: (0 / 0,1/ 0,2/ 0,4/ 0,6/ 0,8 e 1ng).

*Preparar o acido fólico diluindo em etanol.

III- Preservação do soro

Dispensar 5 mL do soro  em tubos e adicionar 25mg de ácido ascórbico em cada tubo. Manter armazenado em -20°C até realização do ensaio.

IV- Preparação das amostras

Do soro preservado com ácido ascórbico, adicionar 5 mL desta amostra em 45mL do meio Tampão Ácido Fólico (M544). Incubar a mistura de soro mais solução tampão a 37°C por 90 minutos. Autoclavar a 121°C por 2,5min. Remover o coágulo de proteína formado (centrifugar a amostra e retirar o sobrenadante para os testes).

V- Procedimento para  a determinação de ácido fólico total

Usar 0,5mL, 1,0mL e 1,5mL ou outros volumes do preparado de soro determinado em IV. Colocar em cada tubo de ensaio 5mL do meio Meio Folic Acid Casei e água destilada suficiente para atingir um volume de 10 mL por tubo. Esterilizar os tubos por 5min. Resfriar imediatamente em banho de gelo. Adicionar 1 gota da suspensão de Lactobacillus casei  ATCC 7469 conforme preparada em II em cada tubo. Incubar por 18-24horas. Após este período, antes de iniciar a leitura dos testes, resfriar por 15-30 minutos para inibir o crescimento bacteriano.

A leitura é realizada a λ=620nm.  A quantidade de ácido fólico na amostra é determinado através dos valores obtidos com a curva padrão considerando a diluição da amostra.

Fica a dica!

Sempre usar tubos que sejam livres de detergentes! Mesmo em quantidades baixíssimas de detergente, este pode levar a resultados errôneos.

Sempre utilizar tubos esterilizados para evitar possíveis contaminações no decorrer da realização dos testes.

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