23 de Março de 2022
O cultivo celular animal (ATC) consiste nos processos de isolamento, propagação e manutenção de células de determinado tecido em um sistema in vitro. Este sistema é composto por elementos essenciais ao desenvolvimento e, também, é constituído por condições ambientais tais como, temperatura, pH, teor de CO2 etc. Todos estes elementos (nutricionais + fatores ambientais) são essenciais para a sobrevivência de tais estruturas celulares.
O cultivo celular animal teve seu desenvolvimento iniciado há mais de um século, onde, no ano de 1897, Leo Loeb (1869 – 1959) havia reconhecido os "princípios gerais" e importância do crescimento de células em ambiente artificial através de seu trabalho com tecidos embebidos em ágar ou coágulos de plasma e implantados em animais, foram a primeira tentativa registrada na literatura para o crescimento de tecidos de animais superiores sob condições artificiais em "ambientes que diferem daqueles encontrados no corpo sob condições naturais".
Leo Loeb
Os primeiros meios de cultura desenvolvidos e usados com sucesso para o cultivo de células animais eram tipicamente compostos de plasma, soro, linfa ou extratos de tecidos. A natureza complexa e indefinida destes constituintes biológicos resultavam em uma grande variabilidade, levava ao aumento do risco de contaminação e impediu a elucidação dos nutrientes mínimos e específicos necessários para apoiar o crescimento das células nestes respectivos meios.
Ao desenvolver um novo método de cultura, sempre se enfrenta vários desafios. Um desses é realizar e garantir a manutenção das células e dos tecidos nos meios devido à grande discrepância entre a cinética celular in vivo e a cinética celular in vitro. A principal razão para tal, é a grande dificuldade em reproduzir um microambiente artificial em que as células se comportam como se estivessem em seu ambiente fisiológico natural.
Um microambiente artificial para células cultivadas é formado por vários fatores, incluindo citocinas, material de suporte, interações célula-célula e manutenção do estresse físico. Dado que vários fatores modulam o comportamento e a função das células cultivadas em condições normais. Células viáveis em condições patológicas são submetidas a combinações ainda mais aberrantes, ou seja, são adicionados ao meios mais toxinas, edemas, ascite e temperatura diferenciada. Esses fatores ambientais anormais levam à ativação de reações patológicas nas células in vivo. Pode-se ver, portanto, que é extremamente difícil reproduzir um microambiente anatômico ou fisiológico simplesmente recorrendo a um sistema de cultura convencional específico.
Por essas razões, muitos grupos de pesquisa procuraram desenvolver meios de cultura quimicamente definidos sem soro (serum-free) por meio da análise da composição celular dos elementos dos soros, onde se procurava mimetizar estes elementos nos meios de cultura, e através da identificação de componentes-chave necessários e essenciais para garantir o desenvolvimento das culturas.
O trabalho pioneiro realizado por Harry Eagle, culminou no desenvolvimento de uma formulação básica, que poderia suportar o crescimento de duas linhagens celulares diferentes, fibroblastos L de camundongo e células HeLa (carcinoma uterino humano).
Harry Eagle
O meio inicial de Eagle continha “uma mistura arbitrária de aminoácidos, vitaminas, cofatores, carboidratos e sais” junto com soro dialisado. Esse meio foi “batizado” de Essential Medium (MEM). O MEM é composto por 28 metabólitos essenciais que, quando suplementados com soro, podem suportar a propagação de uma ampla variedade de linhagens celulares com tempos de duplicação de 18 a 24 h. Embora este meio contenha soro em sua composição, sua formulação ainda é a base para muitos meios de cultura de células amplamente usados até hoje. Como exemplo, o DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) de Dulbecco e Freeman foi resultante de uma versão modificada do meio de Eagle contendo uma concentração quatro vezes maior de aminoácidos e vitaminas em relação ao MEM. Esta formulação demonstrou suportar crescimento aprimorado e densidades celulares mais altas em relação ao MEM e acabou sendo usado como base para várias formulações de meios isentos de soro.
A mistura de nutrientes de Ham F12, foi um exemplo inicial bem-sucedido de um meio de cultura totalmente sintético, quimicamente definido e livre de soro que poderia suportar o crescimento clonal de células de ovário de hamster chinês (CHO- Chinese Hamster Ovary). Este meio (Nutriente Mixture F12- Ham) foi projetado para o cultivo e expansão de células únicas, mas não era adequado para suportar o crescimento de altas densidades celulares (superiores a 105 células por ml).
Sato et al. determinaram posteriormente que essa deficiência poderia ser remediada pela mistura do F12- Ham com o meio de Dulbecco, além da suplementação com hormônios, fatores de crescimento e transferrina, resultando assim em uma nova formulação chamada DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Nutrient Mixture F-12 Ham). Nesta nova composição, Hiroki Murakami et al. identificaram quatro aditivos críticos necessários para a reposição do soro em meios quimicamente definidos: insulina, transferrina, etanolamina e selênio. Combinados, esses quatro aditivos formaram um suplemento (ITES), que foi usado como componente quimicamente definido para substituição do soro. Além disso, a equipe de Murakami melhorou mais os meios existentes misturando formulações já conhecidas, como DMEM/F12 com outras como o RPMI-1640.
Os meios RPMI são uma série de meios desenvolvidos por Moore et al para a cultura de células normais e neoplásicas humanas in vitro. O meio RPMI-1640, por sua vez, é um meio de cultura de células proposto pelo Roswell Park Memorial Institute (Buffalo, NY) que resultou na cultura bem-sucedida de linfócitos humanos.
A mistura do RPMI com o DMEM/F12 juntamente com o suplemento ITES como substituto da remoção do soro, gerou o meio RDF basal e, posteriormente, o RDF enriquecido (eRDF).
Yap et al. avaliaram ainda mais o papel de metais traços em meios de cultura de células sem soro, identificando atividades miméticas à insulina mediadas sobre as culturas através do zinco, o que levou sua demonstração como substituto de insulina em meios quimicamente definidos e isentos de proteínas.
A seguinte tabela apresenta a composição de diferentes meios de cultura clássicos destinados ao cultivo animal.
Usualmente os meios destinados para o cultivo celular animal são preparados a partir do meio desidratado que é reconstituído em água, filtrado em membrana e adicionado os devidos suplementos (nutrientes, antibióticos, fatores de crescimento etc.) ou frequentemente se utiliza dos meios já prontos para o uso.
Nós da Êxodo Científica, distribuidores autorizados da marca HiMedia no Brasil possuímos um dos maiores e mais amplo portfólio apresentando grande variedade e opções de meios clássicos, suas variações e muitos outros materiais destinados para o cultivo celular animal.
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Referências:
- Ritacco, F.V., Wu, Y. and Khetan, A. (2018), Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: History, key components, and optimization strategies. Biotechnol Progress, 34: 1407-1426. https://doi.org/10.1002/btpr.2706.
- Aoki, S., Takezawa, T., Sugihara, H., and Toda, S. (2016) Progress in cell culture systems for pathological research. Pathology International, 66: 554– 562. doi: 10.1111/pin.12443.
- Baust, J.M., Buehring, G.C., Campbell, L. et al. Best practices in cell culture: an overview. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 53, 669–672 (2017). https://doi.org/10.1007/s11626-017-0177-7
-Loeb, L. (1978), On transplantation of tumors. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 28: 369-374. https://doi.org/10.3322/canjclin.28.6.369
-Fangerau H. Front Cell Dev Biol. 2022 Feb 14;9:801333. doi: 10.3389/fcell.2021.801333. eCollection 2021.
- Lee S, Kim BY, Yeo JE, Nemeno JG, Jo YH, Yang W, Nam BM, Namoto S, Tanaka S, Sato M, Lee KM, Hwang HS, Lee JI.Transplant Proc. 2013 Oct;45(8):3108-12. doi: 10.1016/j.transproceed.2013.08.013.
O cultivo celular animal teve seu desenvolvimento iniciado há mais de um século, onde, no ano de 1897, Leo Loeb (1869 – 1959) havia reconhecido os "princípios gerais" e importância do crescimento de células em ambiente artificial através de seu trabalho com tecidos embebidos em ágar ou coágulos de plasma e implantados em animais, foram a primeira tentativa registrada na literatura para o crescimento de tecidos de animais superiores sob condições artificiais em "ambientes que diferem daqueles encontrados no corpo sob condições naturais".
Leo Loeb
Os primeiros meios de cultura desenvolvidos e usados com sucesso para o cultivo de células animais eram tipicamente compostos de plasma, soro, linfa ou extratos de tecidos. A natureza complexa e indefinida destes constituintes biológicos resultavam em uma grande variabilidade, levava ao aumento do risco de contaminação e impediu a elucidação dos nutrientes mínimos e específicos necessários para apoiar o crescimento das células nestes respectivos meios.
Ao desenvolver um novo método de cultura, sempre se enfrenta vários desafios. Um desses é realizar e garantir a manutenção das células e dos tecidos nos meios devido à grande discrepância entre a cinética celular in vivo e a cinética celular in vitro. A principal razão para tal, é a grande dificuldade em reproduzir um microambiente artificial em que as células se comportam como se estivessem em seu ambiente fisiológico natural.
Um microambiente artificial para células cultivadas é formado por vários fatores, incluindo citocinas, material de suporte, interações célula-célula e manutenção do estresse físico. Dado que vários fatores modulam o comportamento e a função das células cultivadas em condições normais. Células viáveis em condições patológicas são submetidas a combinações ainda mais aberrantes, ou seja, são adicionados ao meios mais toxinas, edemas, ascite e temperatura diferenciada. Esses fatores ambientais anormais levam à ativação de reações patológicas nas células in vivo. Pode-se ver, portanto, que é extremamente difícil reproduzir um microambiente anatômico ou fisiológico simplesmente recorrendo a um sistema de cultura convencional específico.
Por essas razões, muitos grupos de pesquisa procuraram desenvolver meios de cultura quimicamente definidos sem soro (serum-free) por meio da análise da composição celular dos elementos dos soros, onde se procurava mimetizar estes elementos nos meios de cultura, e através da identificação de componentes-chave necessários e essenciais para garantir o desenvolvimento das culturas.
O trabalho pioneiro realizado por Harry Eagle, culminou no desenvolvimento de uma formulação básica, que poderia suportar o crescimento de duas linhagens celulares diferentes, fibroblastos L de camundongo e células HeLa (carcinoma uterino humano).
Harry Eagle
O meio inicial de Eagle continha “uma mistura arbitrária de aminoácidos, vitaminas, cofatores, carboidratos e sais” junto com soro dialisado. Esse meio foi “batizado” de Essential Medium (MEM). O MEM é composto por 28 metabólitos essenciais que, quando suplementados com soro, podem suportar a propagação de uma ampla variedade de linhagens celulares com tempos de duplicação de 18 a 24 h. Embora este meio contenha soro em sua composição, sua formulação ainda é a base para muitos meios de cultura de células amplamente usados até hoje. Como exemplo, o DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) de Dulbecco e Freeman foi resultante de uma versão modificada do meio de Eagle contendo uma concentração quatro vezes maior de aminoácidos e vitaminas em relação ao MEM. Esta formulação demonstrou suportar crescimento aprimorado e densidades celulares mais altas em relação ao MEM e acabou sendo usado como base para várias formulações de meios isentos de soro.
A mistura de nutrientes de Ham F12, foi um exemplo inicial bem-sucedido de um meio de cultura totalmente sintético, quimicamente definido e livre de soro que poderia suportar o crescimento clonal de células de ovário de hamster chinês (CHO- Chinese Hamster Ovary). Este meio (Nutriente Mixture F12- Ham) foi projetado para o cultivo e expansão de células únicas, mas não era adequado para suportar o crescimento de altas densidades celulares (superiores a 105 células por ml).
Sato et al. determinaram posteriormente que essa deficiência poderia ser remediada pela mistura do F12- Ham com o meio de Dulbecco, além da suplementação com hormônios, fatores de crescimento e transferrina, resultando assim em uma nova formulação chamada DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Nutrient Mixture F-12 Ham). Nesta nova composição, Hiroki Murakami et al. identificaram quatro aditivos críticos necessários para a reposição do soro em meios quimicamente definidos: insulina, transferrina, etanolamina e selênio. Combinados, esses quatro aditivos formaram um suplemento (ITES), que foi usado como componente quimicamente definido para substituição do soro. Além disso, a equipe de Murakami melhorou mais os meios existentes misturando formulações já conhecidas, como DMEM/F12 com outras como o RPMI-1640.
Os meios RPMI são uma série de meios desenvolvidos por Moore et al para a cultura de células normais e neoplásicas humanas in vitro. O meio RPMI-1640, por sua vez, é um meio de cultura de células proposto pelo Roswell Park Memorial Institute (Buffalo, NY) que resultou na cultura bem-sucedida de linfócitos humanos.
A mistura do RPMI com o DMEM/F12 juntamente com o suplemento ITES como substituto da remoção do soro, gerou o meio RDF basal e, posteriormente, o RDF enriquecido (eRDF).
Yap et al. avaliaram ainda mais o papel de metais traços em meios de cultura de células sem soro, identificando atividades miméticas à insulina mediadas sobre as culturas através do zinco, o que levou sua demonstração como substituto de insulina em meios quimicamente definidos e isentos de proteínas.
A seguinte tabela apresenta a composição de diferentes meios de cultura clássicos destinados ao cultivo animal.
| Componentes (mg/L) | BME (Eagle 1955) | MEM (Minimum Essential Media) (Eagle, 1959) | F12 (Ham, 1965) | DMEM/F12 (Barnes, 1979) | eRDF (Murakami, 1989) | |
| Aminoácidos | Glycine | 7.51 | 3.76 | 42.8 | ||
| L-Alanine | 8.91 | 4.46 | 6.68 | |||
| L-Arginine | 17.42 | 105 | 210 | |||
| L-Arginine HCl | 210.7 | 105.4 | 581.5 | |||
| L-Asparagine | 13.21 | 6.61 | ||||
| L-Asparagine Monohydrate | 94.5 | |||||
| L-Aspartic acid | 13.31 | 6.66 | 39.9 | |||
| L-Cystine | 12.015 | 24 | 48 | |||
| L-Cysteine HCl | 31.52 | 15.76 | ||||
| L-Cysteine HCl H2O | 105.4 | |||||
| L-Glutamic Acid | 14.71 | 7.36 | 39.7 | |||
| L-Glutamine | 292.2 | 292 | 146.1 | 657 | 1000 | |
| L-Histidine HCl H2O | 75.4 | |||||
| L-Histidine HCl | 19.16 | 9.58 | ||||
| L-Histidine | 7.76 | 31 | 62.0 | |||
| L-Hydroxyproline | 31.5 | |||||
| L-Isoleucine | 26.24 | 52 | 3.94 | 105.97 | 157.4 | |
| L-Leucine | 26.24 | 52 | 13.12 | 110.56 | 165.3 | |
| L-Lysine HCl | 36.52 | 18.26 | 197.2 | |||
| L-Lysine | 29.24 | 58 | 116 | |||
| L-Methionine | 7.46 | 15 | 4.48 | 32.24 | 49.2 | |
| L-Phenylalanine | 16.52 | 32 | 4.96 | 66.48 | 74.3 | |
| L-Proline | 34.53 | 17.27 | 55.2 | |||
| L-Serine | 10.51 | 5.26 | 85.1 | |||
| L-Threonine | 23.82 | 48 | 11.91 | 101.96 | 110.8 | |
| L-Tryptophan | 4.084 | 10 | 2.042 | 21.02 | 18.4 | |
| L-Tyrosine | 18.12 | 36 | 5.44 | 74.72 | 87.0 | |
| L-Valine | 23.44 | 46 | 11.72 | 97.86 | 109.0 | |
| Sais Minerais | Calcium Chloride Dihydrate | 44.10 | 22.05 | 108.77 | ||
| Calcium Chloride | 111 | 200 (0 for suspension culture) | ||||
| Magnesium Chloride | 47.6 | |||||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | 200 | 121.98 | 161 | |||
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | 66.22 | |||||
| Potassium Chloride | 373 | 400 | 223.8 | 311.9 | 373 | |
| Sodium Bicarbonate | 1680 | 2000 | 1176 | 2788 | 1050 | |
| Sodium Chloride | 5840 | 6800 | 7592 | 7196 | 6424 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Dihydrate | 150 (1500 for suspension culture) | 750 | ||||
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | 138 | |||||
| Sodium Phosphate Dibasic heptahydrate | 268.1 | 134.1 | ||||
| Sodium Phosphate Dibasic Dodecahydrate | 6593 | |||||
| Elementos Traços | Cupric Sulfate Pentahydrate | 0.002497 | 0.001249 | 0.000749 | ||
| Sodium Selenite | 0.001729 | |||||
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | 0.834 | 0.417 | 0.222 | |||
| Zinc Sulfate Heptahydrate | 0.8625 | 0.432 | 0.23 | |||
| Vitaminas | Biotin | 0.2443 | 0.007329 | 0.003665 | 0.1 | |
| Choline Chloride | 13.96 | 6.98 | 12.29 | |||
| Choline | 0.1042 | 1 | 2 | |||
| Pantothenate | 0.2190 | 1 | 2 | |||
| D-Calcium Pantothenate | 0.4765 | 0.24 | 1.24 | |||
| Folic Acid | 0.4414 | 1 | 13.242 | 2.66 | 1.81 | |
| Niacinamide | 0.1221 | 1 | 0.03663 | 2.02 | 1.47 | |
| p-Aminobenzoic Acid | 0.51 | |||||
| Pyridoxal HCl | 1 | |||||
| Pyridoxal | 0.1672 | 1 | 2 | |||
| Pyridoxine HCl | 0.06169 | 0.03085 | 0.51 | |||
| Riboflavin | 0.03764 | 0.1 | 0.03764 | 0.22 | 0.21 | |
| Thiamine | 0.2654 | 1 | 2 | |||
| Thiamine HCl | 0.3373 | 0.1687 | 1.59 | |||
| Vitamin B12 | 13.554 | 0.68 | 0.34 | |||
| Poliamina | Putrescine 2HCl | 0.1611 | 0.08 | 0.040 | ||
| Fatores de Crescimento | DL-α-Lipoic Acid | 0.2063 | 0.103 | 0.0516 | ||
| i-Inositol | 2 | 18.02 | 13.01 | 46.85 | ||
| Acidos Graxos | Linoleic Acid | 0.08412 | 0.04206 | 0.02103 | ||
| Outros | HEPE | 3574.5 | 1190 | |||
| D-(+)-Glucose | 901 | 1000 | 1802 | 1401 | 3423 | |
| Hypoxanthine | 4.083 | 2.04 | 1.02 | |||
| L-Glutathione, Reduced | 0.49 | |||||
| Phenol Red | 5 | |||||
| Sodium Pyruvate | 110 | 55 | 110 | |||
| Thymidine | 0.7266 | 0.3633 | 5.72 | |||
| Aditivo | 5-10% of serum, plus antibiotics | 5-10% of serum | 5-10% of serum plus Phenol Red | Serum and antibiotics | serum-free |
Referências:
- Ritacco, F.V., Wu, Y. and Khetan, A. (2018), Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: History, key components, and optimization strategies. Biotechnol Progress, 34: 1407-1426. https://doi.org/10.1002/btpr.2706.
- Aoki, S., Takezawa, T., Sugihara, H., and Toda, S. (2016) Progress in cell culture systems for pathological research. Pathology International, 66: 554– 562. doi: 10.1111/pin.12443.
- Baust, J.M., Buehring, G.C., Campbell, L. et al. Best practices in cell culture: an overview. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 53, 669–672 (2017). https://doi.org/10.1007/s11626-017-0177-7
-Loeb, L. (1978), On transplantation of tumors. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 28: 369-374. https://doi.org/10.3322/canjclin.28.6.369
-Fangerau H. Front Cell Dev Biol. 2022 Feb 14;9:801333. doi: 10.3389/fcell.2021.801333. eCollection 2021.
- Lee S, Kim BY, Yeo JE, Nemeno JG, Jo YH, Yang W, Nam BM, Namoto S, Tanaka S, Sato M, Lee KM, Hwang HS, Lee JI.Transplant Proc. 2013 Oct;45(8):3108-12. doi: 10.1016/j.transproceed.2013.08.013.
